Mikołaj urodził się w Castel Sant Angelo (obecnie Sant Angelo di Pontano), we Włoszech, w roku 1245. Na chrzcie otrzymał imię Mikołaj, gdyż rodzice prosili o syna przez wstawiennictwo św. Mikołaja z Bari - matka była bowiem od wielu lat niepłodna. W podzięce rodzice ofiarowali syna, gdy miał zaledwie 12 lat, jako oblata do zakonu augustianów (1257). W trzy lata potem młodzieniec wstąpił do nowicjatu. W domach zakonnych w Tolentino i w Cingoli odbył studia średnie, a potem studia w zakresie filozofii i teologii. Święcenia kapłańskie otrzymał z rąk św. Benvenuta, biskupa Osimo, w roku 1269 w Cingoli, w wieku 24 lat.
W latach 1269-1275 Mikołaj pełnił funkcję misjonarza-kaznodziei: w Macerata, w Piaggiolino di Fano, w Montegiorgio, w Corridonio, w San Elpidio, w Recanati, w Treia, w Valmente di Pesaro oraz w Fermo. W latach 1275-1305 - przez 30 lat - przebywał w Tolentino.
W posłuszeństwie zakonnym był tak doskonały, że wypełniał nie tylko najdrobniejsze nawet nakazy reguły, ale i życzenia swoich przełożonych. Chętnie spełniał także życzenia swoich współbraci, chociaż niektórzy z nich byli od niego młodsi i mniej zasłużeni. Był tak bardzo skromny, że nigdy nie podnosił oczu: na słuchaczy, na rozmówców, na penitentów w sakramencie pokuty. Miał tylko jeden habit, a na noc okrywał się swoim wytartym płaszczem. W uczynkach pokutnych naśladował ascetów pierwszych wieków chrześcijaństwa: co piątek biczował się do krwi specjalnie przez siebie sporządzoną wymyślnie dyscypliną; nigdy nie jadł mięsa, nabiału ani owoców; cztery razy w tygodniu pościł o chlebie i wodzie, podobnie we wszystkie dni Wielkiego Postu z wyjątkiem niedziel. Sypiał trzy do czterech godzin na dobę; oprócz Mszy świętej, którą odprawiał ze szczególną żarliwością, odmawiał wspólnie brewiarz, a ponadto psalmy pokutne, oficjum o Świętym Krzyżu i o zmarłych. Wszystkie te pacierze odmawiał na kolanach, na posadzce kamiennej. Chociaż był tak surowy dla siebie, był niezwykle wyrozumiały dla bliźnich, zwłaszcza dla grzeszników w konfesjonale. Spowiadał bardzo wiele, gdyż sława jego świętości gromadziła przy jego konfesjonale nieraz całe tłumy.

Był szczególnie wrażliwy na niedolę ubogich. Umiał przemawiać do zamożnych, by dzielili się chętnie swoją majętnością z tymi, którzy są głodni. Za zezwoleniem przełożonych utworzył stały fundusz dla ubogich. Bywało, że mył im nogi.
Największą jednak sławę Mikołaj zdobył swoją pracą kaznodziejską. Zatroskany o wieczne zbawienie dusz nieśmiertelnych, okupionych tak wielką ceną męki i śmierci Syna Bożego, wykorzystywał każdą okazję, by przemawiać i kruszyć serca. Jego żarliwość apostolska i widok wychudłej od postów twarzy przemawiał wymowniej od najpiękniejszych słów. Swoje cierpienia i pokuty miał zwyczaj ofiarowywać za nawrócenie grzeszników.
Pan Bóg obdarzył go niezwykłymi charyzmatami. Mikołaj miał rzadki dar łączności z duszami w czyśćcu cierpiącymi. W procesie kanonicznym stwierdzono ponad 300 wypadków cudownych uzdrowień, jakie wierni otrzymali za przyczyną Mikołaja tak za jego życia, jak i po jego śmierci. Wśród nich są wymienione trzy wypadki wskrzeszenia umarłych: 12-letniej córki Filipa z Fermo - cud potwierdzony przysięgą czterech kapłanów-świadków (1306); wskrzeszenie córki Jacopuzzo z Chieti (1320) i Venturyna z Gigliolo, potwierdzone przez niego, jego ojca, żonę i biskupa Maceraty.

Mikołaj zmarł w Tolentino 10 września 1305 roku. Jego pogrzeb był wielką manifestacją miasta i okolicy. Pochowano go w kościele klasztornym. Kiedy w roku 1345 odjęto od ciała dwie ręce, by je umieścić w drogocennych relikwiarzach, według kroniki klasztoru z ciała nienaruszonego rozkładem miała wypłynąć obficie krew. Ta sama kronika wspomina, że fakt płynięcia krwi miał się powtórzyć w ciągu wieków jeszcze kilka razy. Papież Eugeniusz IV w roku 1446 wyniósł Mikołaja uroczyście do chwały świętych. Jego kult zakon augustianów rozniósł po całym świecie. Jego główne sanktuarium znajduje się w Tolentino. Pierwotny kościół klasztorny pw. św. Jerzego powiększono i dano mu nowy tytuł - św. Mikołaja. Sanktuarium nawiedziło 12 papieży, 9 świętych i błogosławionych, 38 królów i książąt (wśród nich sam Napoleon i nasza królowa, Maria Kazimiera, żona króla Jana III Sobieskiego).

Ikonografia przedstawia zwykle św. Mikołaja z Tolentino w czarnym habicie augustianina z regułą w ręku na znak sumiennego jej zachowania; z lilią w ręku, symbolem niewinności jego serca; z krzyżem w ręku, który oznacza ducha pokuty i z gwiazdą na piersiach lub nad głową Świętego, gdyż świadkowie mieli ją kilka razy nad nim oglądać.