Justyna należała do najznakomitszych mieszkanek Padwy, a jej rodzina była jedną z najzamożniejszych w mieście. Justyna przyjęła chrzest z rąk pierwszego biskupa Padwy - Prosdocyma, który również został zaliczony w poczet świętych. Złożyła prywatny ślub czystości i nigdy nie wstydziła się imienia Chrystusa Pana, mając świadomość, że jest to jedyne imię, w którym człowiek może być zbawiony.
Kiedy wybuchło prześladowanie chrześcijan za cesarza Dioklecjana, została pojmana i zaprowadzona przed namiestnika, który równocześnie sprawował najwyższą władzę sądowniczą w prowincji Włoch, Maksymiana Galeriusza. Nakazano jej wyrzec się wiary w Jezusa, a kiedy odmówiła i gdy zawiodły wszelkie próby, by odwieść ją od wiary Chrystusowej, została skazana na śmierć przez ścięcie mieczem. Karę wykonano 7 października 304 roku. Według legendy miał to być miecz dopiero co wykuty, jeszcze gorący, co dodatkowo miało upokorzyć dziewczynę, ponieważ takimi mieczami zabijano niewolników jako pierwsze ofiary. Justyna z pokojem w sercu oddała swoje życie i swoją duszę Jezusowi, dziękując, że przyjął jej ofiarę - i z modlitwą na ustach zakończyła swoją ziemską drogę.
Gdy tylko ustały prześladowania w 10 lat po edykcie mediolańskim, wydanym przez cesarza Konstantyna I Wielkiego w 313 roku, na grobie Justyny wystawiono kaplicę. Z końcem zaś wieku V i na początku wieku VI prefekt miasta Padwy, Opilione, wystawił nad tym grobem bazylikę. Kościół mediolański włączył jej imię do kanonu Mszy świętej. Grób Świętej stał się ulubionym miejscem pielgrzymek. Jej kult rychło rozszedł się po północnych Włoszech, czego dowodem jest również jej wizerunek umieszczony w mozaice bazyliki św. Apolinarego (Nuovo) w Rawennie z wieku VI. Św. Wenancjusz Fortunat w niejednym utworze wychwalał heroiczną patronkę miasta Padwy. Była także czczona w Rimini, a w Como biskup Agrypin wystawił ku jej czci osobną kaplicę w dziesiątą rocznicę swojej konsekracji. W roku 1117 trzęsienie ziemi zniszczyło bazylikę, wystawioną przez Opiliona. O wiele wspanialszą świątynię odbudowali benedyktyni, którzy od wieku VIII mieli przy kościele św. Justyny w Padwie swoje opactwo. W latach 1521-1587 ozdobili bazylikę jeszcze okazalej, tak iż stanowi ona klejnot architektury Padwy. W 1627 roku relikwie św. Justyny przełożone zostały do nowej, cyprysowej trumny, bogato złoconej na zewnątrz. Benedyktyni z Padwy rozszerzyli kult św. Justyny po całej Europie. Kiedy zaś w jej doroczną pamiątkę 7 października 1571 roku zostało odniesione zwycięstwo nad flotą turecką pod Lepanto, jej wstawiennictwu przypisano zwycięstwo. Po kasacie klasztoru i zamknięciu kościoła przez wojska napoleońskie w 1810 roku, kult Justyny znacznie osłabł. Od roku 1919 benedyktyni na nowo objęli opactwo i kult Świętej wznowili. Bazylika i opactwo benedyktyńskie znajdują się przy jednym z największych placów w Europie - Prato della Valle. Benedyktyni nadal opiekują się bazyliką i rozszerzają kult Świętej. Obecnie ciało św. Justyny znajduje się pod głównym ołtarzem bazyliki, w której to spoczywają także ciała św. Prosdocyma, a także św. Łukasza Ewangelisty.